我室洪伟副教授与奥本大学（美国）王义研究组共同开发了基于CRISPR-Cpf1的艰难梭菌多重基因编辑系统

艰难梭菌（Clostridioes difficile）是一种革兰氏阳性、产芽孢、专性厌氧细菌，是医院相关性腹泻的主要病原体。近年来，随着强毒株的出现，其流行性与致死率逐年上升，因此对艰难梭菌生理、生化特征及致病机制的研究受到广泛重视。艰难梭菌生理、生化特征及致病机制研究又以建立其稳定、高效的基因编辑方法为必要前提。

艰难梭菌基因编辑技术经历了反义RNA 干扰技术、Clostron 技术、转座子随机基因失活技术、ACE 技术和CRISPR-Cas 技术等不同发展阶段。本研究开发了基于CRISPR-Cpf1在艰难梭菌中的多重基因编辑系统[Hong W , Zhang J , Cui G , et al. 2018, 7(6): 1588–1600]。除此之外，我们还为CRISPR-Cpf1多重基因编辑系统开发了靶位点寻找和突变引物设计软件 (OSA primer finder，OPF)，可以在1分钟内设计好构建打靶载体所需的引物，极大地提高了艰难梭菌的基因编辑载体构建的效率。

使用该工具我们成功编辑了C. difficile 630菌株fur (ferric uptake regulator)、tetM (tetracycline resistance protein) 、ermB1/2 (erythromycin resistance protein 1/2)、cwp66、tcdA (Toxin A)、phiCD630-2 (CD630 phage-2) 基因，基因敲除效率从25%–100%不等。另外，基于该系统的打靶质粒可以通过连续传代的方式丢失，因此能够实现抗性基因的回收，从而实现使用同一筛选标记连续敲除不同基因 (如tetM和erm1/2 基因)。综上所述，我们开发的CRISPR-Cpf1“工具箱”可以极大加速艰难梭菌基因编辑进程，为揭示艰难梭菌生理、生化特征，致病机制和开发对抗CDI的新疗法提供技术支持。

该研究已发表在ACS Synth Biol [Hong W , Zhang J , Cui G , et al. 2018, 7(6): 1588–1600]。洪伟，张杰为共同第一作者，王义教授为通讯作者。该项工作得到了国家自然科学基金（31601012，31560318）的支持。

图1. 使用CRISPR-Cpf1 技术实现在艰难梭菌中的多重基因编辑

原文链接: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.8b00087